Под музей была выделена юго-западная башня монастырского комплекса. В ней ранее размещалась библиотека и монастырская ризница, для которой в 1910 году было отстроено новое отапливаемое здание по проекту архитектора Л. П. Шишко. Заведующим музеем был назначен архимандрит Филарет. Основная работа по устройству древлехранилища была возложена на художника Андрея Андреевича Карелина и послушника Лавры Федора Михайловича Морозова, который со времени своего пребывания в монастыре собирал лаврские древности — предметы, вышедшие из употребления. В организации музея принимали участие также А. Н. Бенуа, В. Т. Георгиевский и иконописец М. В. Тюлин, а также редактор журнала "Старые годы" барон Н. Н. Врангель, его сотрудник П. П. Вейнер и сын знаменитого ювелира А. К. Фаберже. Используя опыт организации историко-художественного музея в Нижнем Новгороде, А. А. Карелин в короткий срок сумел организовать отбор предметов и их классификацию.


В 1910 году музей был открыт для публики.

16 марта 1910 года по приглашению А. А. Карелина музей посетила великая княгиня Мария Павловна, президент Императорской Академии художеств. Этот день стал считаться днем его официального открытия. В своем письме митрополиту Антонию она указывала, что музей произвел на нее "глубоко отрадное впечатление". Владыка благословил расширить Древлехранилище.



Музей был открыт ежедневно с 14 до 16 часов, кроме канунов праздничных дней.

Постепенно музей пополнялся новыми ценными экспонатами. Например, в 1910-1913 годах лаврский иеромонах Гавриил пожертвовал старинное деревянное Распятие, а начальник архива Синода, историк К. Я. Здравомыслов - старинные оловянные сосуды XIII-XIV веков. В 1913 году по ходатайству Морозова из Академии художеств в музей были переданы фотоснимки из экспедиции П. В. Севастьянова на Афон, а также гипсовые слепки с древней резьбы по кости и виды священных сюжетов, хранившиеся в западноевропейских музеях.

В 1912 и 1915 годах музей принял участие в грандиозных историко-художественных выставках.

24 марта 1917 года, согласно постановлению Духовного Собора, Древлехранилище было закрыто для посторонней публики ввиду революционных потрясений.

Музей был окончательно закрыт в 1922 году в разгар кампании по изъятию церковных ценностей, в ходе которой материальные ценности, принадлежавшие монастырю, были конфискованы "в пользу голодающих". Часть экспонатов была перевезена в Русский музей: иконы (значительная часть из них принадлежала старообрядческой традиции), облачения и другие предметы. Одним из самых древних таких экспонатов является покров на раку св. Александра Невского, привезенный из Владимира в Санкт-Петербург вместе с мощами благоверного князя в 1724 году. Покров был выполнен в середине XVII века и изображал Александра Невского в монашеском одеянии, что противоречило иконографии святого в синодальный период (Александр Невский в княжеском одеянии). Покров хранился в Лаврской ризнице, а затем в Древлехранилище.

После закрытия Древлехранилища в 1922 году и перевозки части экспонатов из него в Русский музей, защитники Лаврского музея сразу начали готовить проект его возобновления. Теперь Древлехранилище планировали разместить на втором этаже новой ризницы. Однако эта идея была реализована лишь спустя 90 лет.

Современное Древлехранилище Александро-Невской лавры было воссоздано в декабре 2013 года, в год 300-летнего юбилея монастыря, после почти 90-летнего перерыва.

Во второй половине ХХ века здание Древлехранилища занимала станция переливания крови. В зале, где сегодня размещена экспозиция, располагался отдел консервации крови. Для нужд станции здание было переделано, и после его передачи Александро-Невской лавре в начале ХХI века началась реставрация, вернувшая помещениям исторический облик.

Своим существованием Древлехранилище Лавры во многом обязано трудам Лидии Ивановны Соколовой, секретаря епархиальной комиссии по канонизации. С 2008 года она кропотливо собирала материалы, принимала на хранение предметы, договаривалась с экспертами о проведении датировок и атрибуции.

Как ни удивительно, первыми предметами, вошедшими в собрание монастырского музея, были настоящие тюремные нары и тюремная дверь из одиночной камеры Дома предварительного заключения на Шпалерной улице, построенного в 1878 г. (в настоящее время - следственный изолятор №3 ФСИН). В 1920-е гг. бывший Дом предварительного заключения стал следственной тюрьмой Ленинградского управления ОГПУ-НКВД-МГБ-КГБ. Однако неслучайно предметы из Дома предварительного заключения оказались именно в Александро-Невской лавре: сидельцами этой тюрьмы были многие священнослужители и верующие, пострадавшие за веру в послереволюционные десятилетия.

Тема новомучеников была раскрыта на первой выставке, разместившейся в стенах Древлехранилища. Передвижная выставка с названием "Non licet vos esse", подготовленная совместно Александро-Невской лаврой, культурно-историческим фондом "Преображение", Свято-Филаретовским православно-христианским институтом, литературно-краеведческим музеем Константина Бальмонта, кроме петербургской Александро-Невской лавры, была представлена в нескольких других городах России.
«Эта выставка станет предтечей нашего музея, поскольку сейчас он находится только в стадии формирования. У нас есть множество икон, которые хотелось бы выставить, но пока музей только начинает работу, нам нужно немного освоиться на этом месте. Коллекция постоянно пополняется, люди приносят очень редкие иконы», — сказала на открытии выставки Лидия Ивановна Соколова.

22 января 2017 года постоянная экспозиция музея Древлехранилище Александро-Невской лавры была торжественно открыта. Консультативно-методическую помощь при организации экспозиции оказывали сотрудники государственных музеев.

Музей устраивает временные внутренние и обменные выставки, ежегодно принимает участие в "Форуме малых музеев", сотрудники участвуют в международных, всероссийских и региональных научных конференциях.